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针对上述问题，中科院动物所的顾奇团队构建了一种可3D打印的物理-化学异质微凝胶-水凝胶杂化材料（GMMHM）。该材料兼具高力学强度（抗生理剪切力）和柔软表面（促进内皮细胞黏附、血管新生），并具剪切稀化及自愈合特性，可同时用于嵌入式和挤出式生物打印。利用GMMHM，作者构建了含1亿细胞/mL的厚血管化肝组织，内嵌可手术吻合的宏观血管通道。将其植入85%肝切除的SD大鼠后，移植物在术中即可与宿主血管直接吻合，实现瞬时血流灌注并快速恢复肝功能，显著延长动物存活时间，为急性肝衰竭等疾病的可移植治疗给予了新的技术平台。该文章于2025年4月4日以《A Microgel–Hydrogel Hybrid for Functional Compensation and Mechanical Stability in 3D Printed Cell-Dense Vascularized Liver Tissue》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202413940）。

图1 3D生物打印微凝胶-水凝胶混合物用于可植入血管化肝组织的示意图

（1）微凝胶-水凝胶杂化材料的设计

为了实现水凝胶封装细胞的治疗应用并促进其与宿主血管的直接吻合，开发了一种具有“双重”软硬特性的微凝胶-水凝胶混合物。GelMA微凝胶、HA-MA前体和Matrigel混合形成了GMMHM混合物，经过紫外线辐射和37°C培养，利用化学交联和物理缠绕的协同作用（图2A）。HA-MA大分子作为“绳索”交联微凝胶以稳定整体结构。GMMHM的微环境顺利获得内部密集交联和外部松散交联增强了弹性特性，并支持细胞活动。GelMA具有热敏性，微凝胶在37°C时会失去结构完整性。GMMHM水凝胶在紫外线辐射后形成，并在37°C下稳定。顺利获得不同的GMM替代度（45%、60%、75%）制备了三组微凝胶，且较低的替代度导致水凝胶结构的损坏。为增强共价交联，将HA-MA前体添加至GMM中，75%替代度的GMM在37°C下稳定。交联后的GelMA微凝胶的弹性模量顺利获得原子力显微镜测试，结果表明不同微凝胶内部和之间的空间异质性（图S2B）。顺利获得调节HA-MA浓度和GMM浓度，水凝胶的机械性能显著变化，0.04% HA-MA与2.5% GMM组合可显著增加有效杨氏模量（Eff.Y.mod）（图2B，C）。进一步优化顺利获得加入Matrigel的GMMHM水凝胶，增强稳定性和生物相容性，其机械性质类似于GMMHM（图2F，G）。力学性能测试显示GMMHM水凝胶的韧性和压缩性优于GMM（图S2C，F）。水凝胶的微孔结构对机械性能和细胞生长至关重要，冷冻扫描电镜（cryo-SEM）显示GMMHM微结构具有显著异质性，内部结构密集交联，外部松散交联（图2H，I，J）。GMMHM的微孔结构显著高于均匀水凝胶，支持了细胞附着和质量运输（图2K）。

图2（A）顺利获得改变UV与37 °C处理顺序构建GMMHM与GMMHM−杂化水凝胶的示意图；（B-H）依次为不同HA-MA、GMM、GelMA浓度及体系对比的弹性模量或储能模量结果；（I-K）展示GMM、GMMH、GMMHM、GMMHM−及GMHM水凝胶的交联结构示意图、冷冻SEM图像（黄色示微凝胶，标尺100 μm）及其孔面积占比与分布差异

（2）顺利获得嵌入式打印制造具有大血管的直接血管吻合术

为实现营养物质传递和功能补偿，工程化厚组织需要具有层次化大血管，能够与宿主血管吻合，并能承受灌注带来的机械剪切应力。GMMHM水凝胶混合物中的微凝胶为嵌入式3D打印给予足够支持，作为模板形成所需的血管通道。顺利获得平行板几何和振荡剪切流变学测试，评估了该混合物的流变特性（图3A）。压实后，混合物表现出强烈的剪切稀化行为（图3B，C）。在5%和100%应变下，混合物展示了应变屈服和自愈合行为（图3D）。当温度低于32°C时，混合物在低频下表现为固体反应（图3E）。频率增加至13 Hz时，混合物呈现宾汉流体行为，损失模量超过储能模量（图3F）。紫外线照射和37°C培养后，混合物交联以保持结构完整性，墨水的储能模量降至5 Pa，易于去除（图3F）。因此，GMMHM混合物可作为支持水凝胶混合物，用于生物打印宏观血管网络并在交联后稳定通道（图3G）。GMMHM能作为挤出矩阵进行生物打印。使用250 μm和400 μm喷嘴打印嵌入式3D螺旋通道，观察到宾汉流体行为（图3H–J）。喷嘴直径直接影响墨水直径，从而形成螺旋结构（图3M）。不同打印速度影响通道直径，例如，250 μm喷嘴可用于打印不同直径的通道（253和750 μm）（图3K,L）。为了制造层次化大血管，打印了1-2-4通道模型（图3N,O）和双螺旋通道模型（图3P–R；）。去除墨水后，绿色染料溶液被灌注到打印的交联混合物通道中。

图3（A）嵌入式挤出打印构建GMMHM宏观血管示意图；（B）振荡流变、黏度、时间-温度扫描及UV/37 ℃处理后的储能模量变化；（C）不同喷嘴直径与打印速度对螺旋管腔直径的影响；（D）一分二、四分叉及双螺旋通道的光学图像与示意图；（E）GMMHM打印血管与宿主颈总动脉-颈静脉直接吻合实现即时血流的示意图及实拍

（3）3D生物打印结构中的初步血管生成和血管生成

为了模拟多尺度血管网络，GMMHM水凝胶混合物中微凝胶给予支持，有助于内皮细胞自组装和血管形成。顺利获得封装RFP-HUVECs和HFF聚集体于GMMH和GMMHM水凝胶中，研究了血管形态发生与血管生成。在GMMHM中，血管芽生长和分支较为明显，GMMHM+加成长因子后，形成了更复杂的血管网络（图4B）。与此相比，GMMH水凝胶网络较少，细胞聚集较多。使用MMP抑制剂GM6001处理后，GMMHM+中的血管生成显著减少，表明血管生成依赖于水凝胶结构的降解（图4D,E）。扫描电子显微镜（SEM）结果显示，GMMHM+形成的毛细血管结构较长且较多（图4C）。进一步评估GMMHM+的血管生成能力时，RFP-HUVECs在GMMHM+表面形成了致密单层，显示出良好的细胞间互作（图4F,H）。顺利获得直接注射RFP-HUVECs，观察到内皮细胞层在管腔表面形成，并顺利获得微通道渗透FITC标记的葡聚糖，证明了内皮屏障功能。剪切应力作用下，血管芽从内腔扩展至GMMHM+水凝胶中，表现出较强的血管生成能力，远超GMHM+水凝胶（图4K）。血管生成后，绿色荧光微珠顺利获得新形成的腔道进入水凝胶，证明了血管生成支持营养物质输入（图4L）。3D共聚焦显微镜图像显示，内皮细胞附着并向水凝胶扩展（图4M）。以上结果表明，GMMHM+水凝胶顺利获得微孔结构和异质刚度促进了血管网络的形成，包括血管生成和血管生成过程（图4I,J）。

图4（A）GMMHM+水凝胶介导的血管新生、内皮化与出芽模式示意图；（B-D）3 d共培养RFP-HUVEC/HFF在多种凝胶中的血管生成3D重构、SEM及管长/分支点定量；（E-G）HUVEC二维黏附、覆盖率随时间变化及CD31免疫染色；（H-K）微通道内HUVEC出芽、FITC微球示踪灌注及5 d厚组织内3D血管网络

（4）支持MSC和实质细胞活性

为了评估异质结构对细胞活力的影响，不同类型的细胞分别被包裹在GMMHM和GMMHM−水凝胶混合物中。HUVEC-HFF聚集体在GMMHM中的生物相容性显著优于GMM和GMMH（水凝胶），细胞在微凝胶表面展召开现了优良的扩展性和分布（图5B、E）。GFP-MSCs在微凝胶表面的共聚焦显微镜图像显示，MSC细胞展布广泛，呈现典型的成纤维样形态，且GMMHM的异质结构使细胞比在均匀结构的GMMHM−中分布更广（图5C、D、F）。这些结果表明，微凝胶的添加增强了细胞活性，可能与其较高的刚度和微孔结构有关（图5A）。为了验证GMMHM在支持原代肝细胞和ESC分化心肌细胞功能上的潜力，分别使用了原代人肝细胞（PHHs）和ESC分化心肌细胞作为模型。PHHs在GMMHM中培养后，维持了均一的活细胞群体（图5G）。与GMMHM相比，PHHs在GMMHM中的代谢活性显著提高，表现出更高的I期酶（CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4）表达，显示了潜在的肝组织构建能力（图5H）。此外，经过20天培养后，分化的心肌细胞在GMMHM中表现出明显的自发收缩，表明GMMHM能有效支持不同组织模型的构建。这些结果表明，GMMHM水凝胶可以作为多种组织模型的支架。

图5（A）GMMHM与GMMHM−内细胞活性示意图；（B）HUVEC/HFF共培养24 h活/死染色；（C-D）GFP-MSC在两种凝胶中第1、3、5天形态及分支面积定量；（E）GMM、GMMH、GMMHM中HUVEC/HFF 24 h存活率；（F-G）PHH活/死染色及CYP1A1、1A2、3A4代谢活性对比

（5）优化三维空间构建组织模型的HCD方法

在模拟生理组织的水凝胶中，细胞密度是工程化组织成熟和功能的关键因素之一。3D生物打印的最大细胞密度为10M/mL，远低于体内组织的细胞密度。以细胞聚集体为基础的工程组织可能存在坏死区域，且更容易受到血管网络密度的影响。顺利获得平衡水凝胶混合物的刚度、组分比例与组织中的高细胞密度（HCD）可实现大血管网络的构建（图6A）。肝脏组织（图6B）含有约100M/mL的肝细胞，具有密集的细胞微环境和血管（图6C）。肝脏组织的弹性模量（Eff.Y.mod）分布呈现异质性（图6J）。随着细胞数量的增加，组织的体积明显增加（图6D）。HepG2和原代猪肝细胞（PPHs）的体积分别为350 μL和550 μL，约构成1亿个细胞（图S9C）。当细胞浓度为50M/mL时，GMMHM的Eff.Y.mod显著下降，导致无法进行植入（图6E）。为了优化基质，1mL肝组织中的水凝胶体积设定为450 μL，以维持100M/mL的细胞密度（图6F）。SEM图像显示细胞被水凝胶混合物包裹，呈蜂窝状结构（图6G-I）。含有0.6% GMM和0.56% HA–MA的水凝胶混合物的Eff.Y.mod与肝脏表面相当（图6K）。该水凝胶具有优异的生物相容性（图6L），适用于后续构建具有HCD的植入肝脏组织。HepG2细胞的HCD增加了混合物的剪切模量，而未影响其压缩模量（图6M,N），增强了混合物的稳定性，以承受血流。所有结果表明，新设计的GMMHM混合物（nGMMHM）适合用于构建具有高细胞密度的组织。

图6（A）高细胞密度肝组织构建示意图；（B）小鼠肝组织光学图及内部SEM（50 μm）；（C）100 M HepG2/PPH分布量化；（D）含/不含100 M PPH的GMMHM弹性模量对比；（E）不同GMM/HA-MA配比及含/不含HepG2的冷冻-SEM（黄：微凝胶，粉：细胞，100/20 μm）与SEM（10 μm）；（F）肝组织不同区域与GMMHM配比的弹性模量、剪切模量、压缩模量及HepG2存活率比较

（6）细胞-高密度水凝胶杂化物促进肝脏功能的研究

研究表明，高细胞密度（HCD）在保证细胞间相互作用和促进组织形成方面起着关键作用。除了评估细胞存活率外，还对HepG2和PPHs在混合培养中7天后的肝功能进行了评估。免疫染色和qPCR结果表明，HepG2基质中人类白蛋白（hAlb）和α1-抗胰蛋白酶（AAT）表达水平较高。此外，肝脏特异性基因（如肝细胞核因子4α（HNF4α）和非半乳糖蛋白受体1（ASGPR1））的表达也有所上升，表明肝细胞功能的成熟（图7A，B）。ALB和CK18的表达与细胞密度显著相关，进一步验证了HCD的重要性（图7C，D）。HNF4α的高表达表明肝细胞在混合物中的成熟（图7E）。这些结果表明，组织中PPH细胞的密度越高，肝功能越强，表明HCD对于人工肝组织的构建至关重要。此外，评估了顺利获得嵌入式生物打印在nGMMHM中构建大血管的性能。添加黄原胶（XG）后，GMMH中的3D“+”通道结构和2D“一对二”通道的保真度有所提高（图S10C，D）。XG浓度增加导致混合物的粘度增大。添加了0.5 wt% XG的GMMH混合物与1.2 wt% XG的混合物粘度相当（图S10F）。交联后的储能模量未受XG或Matrigel影响。然而，含HepG2和HCD的混合物储能模量从500 Pa增加到820 Pa。因此，选择含0.5% XG的nGMMHM配方用于后续实验。

图7（A、B）体外培养7天的不同细胞密度的PPH肝组织的免疫染色共聚焦荧光图像（比例尺：50 μm）。（C-E）不同细胞密度的PPH杂交体中AL B、CK 18和HNF 4β表达水平的比较

（7）SD大鼠工程化血管化肝的快速功能支持

3D生物打印的器官在体外构建为解决器官捐献不足给予了潜力。为在急性肝衰竭的SD大鼠中给予肝脏功能支持，将生物打印的具有高细胞密度（HCD）的血管化组织直接与宿主血管进行外科吻合（图8A）。这证明了在体内肝功能的补偿作用。顺利获得85%的肝切除术建立急性肝衰竭模型（图8A，B），结果显示，移植含有PPHs的工程肝组织可延长生存时间，从2.5小时增加到12小时，表明移植的肝组织对损伤的肝脏给予了功能补偿。与HepG2组相比，PPHs组表现出更好的补偿效果（图8E）。血液生化分析显示，经过PPHs治疗3小时后，血清氨水平显著降低，表明PPHs组对解毒有直接或间接支持作用（图8G）。此外，AST、GLB和ALT水平降低，进一步证明肝损伤得到改善。工程肝脏在移植后3小时和10小时被取出分析（图8I）。组织中的通道内含有红血球，表面平滑无纤维蛋白沉积，表明通道通畅。与远离通道的细胞相比，细胞形态变化不明显，且ALB的表达在10小时时显著高于3小时样本。此外，移植5天后的100 M/mL HepG2组织也显示ALB表达增加，表明工程肝组织具有一定功能。这些结果表明，工程肝组织有效支持肝脏功能并减轻PH引起的高氨血症。

图8（A）血管化肝组织经颈总动脉-颈静脉直接吻合植入85%肝切除衰竭大鼠示意图；（B）手术造模及切除肝脏照片；（C）六角棱柱移植物内红色通道与绿色荧光微粒示踪（标尺1 mm）；（D）吻合后移植物血流灌注及植入体实物图；（E）移植组与对照组生存曲线、血红蛋白及血氨、AST、ALT、GLB、A/G、ALB生化指标；（F）移植3 h与10 h肝组织HE与ALB染色（标尺20×50 μm、63×20 μm）