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研究背景：

针对上述问题，重庆医科大学曹阳教授团队设计了一种靶向血栓的多功能纳米复合材料，结合光热治疗、药物输送和微环境调控，旨在实现协同溶栓。具体包括利用高生物相容性且具有吸附和导热特性的多孔法明蓝（MPB）纳米颗粒负载血栓溶解药物UK，并在其表面包覆血小板膜以实现靶向。该复合材料在808 nm激光照射下能促进局部加热、同时释放UK和一氧化氮（NO），实现光热-药物联合的高效溶栓，同时抑制ROS、补充NO，防止血栓复发，并具有良好的影像检测能力，为血栓的精准治疗给予了新思路。该文章于2025年4月15日以《Mechanical Biomimetic Nanocomposites for Multidimensional Treatment of Arterial Thrombosis》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202501134）。

研究示意图

（1）MPB-NO-UK@PM的表征

MPB-NO 由直径约 150 nm 的均匀方形颗粒组成，其制备方法为将 SNP 嵌入 MPB 框架（图 1A, B）。FTIR 光谱显示 MPB-NO 存在 N=O 振动峰，证明 SNP 已成功嵌入 MPB 框架（图 1C）。元素映射证实 MPB-NO 中氧元素分布均匀（图 1D）。透射电子显微镜图像显示 MPB-NO-UK 具有核壳结构，证明血小板膜成功包覆（图 1E）。DLS 结果表明，血小板膜包覆后，MPB-NO-UK 的平均直径从 182.2 ± 4.7 nm 增加到 202.6 ± 2.9 nm（图 1F）。SDS-PAGE 结果显示 MPB-NO-UK@PM 上的血小板膜与源血小板膜具有一致性，表明血小板膜包覆保持了其完整性（图 1G）。zeta电位测量结果显示，MPB-NO 和 UK 的电位相反，有利于提高 UK 的载药效率（图 1H）。MPB-NO-UK@PM 纳米粒子的粒径和分散性在一周的实验周期内保持稳定（图1I）。

图1 纳米复合材料的表征。（A,B）MPB-NO的TEM和HRTEM图像；（C）MPB-NO和MPB的FTIR光谱；（D）MPB-NO的元素分布图；（E）MPB-NO-UK@PM的TEM图像；（F）MPB-NO-UK和MPB-NO-UK@PM的粒径分布；（G）PM和MPB-NO-UK@PM的SDS-PAGE分析，1表示PM，2表示MPB-NO-UK@PM；（H）MPB-NO、UK、PM和MPB-NO-UK@PM的电位；（I）MPB-NO-UK@PM在一周内的粒径分布和多分散指数（PDI）

（2）MPB-NO-UK@PM的体外性质

808 nm 激光照射 10 min，MPB-NO 升温 21.8 °C，PBS 无变化（图 2A）；MPB-NO-UK@PM 的升温幅度随浓度和功率线性增加（图 2B–D）。710 nm 激发下，其光声信号强度与浓度呈线性关系（图 2D）。MPB-NO 仅在激光辐照时释放 NO，SNP 及 MPB 无响应（图 2F）；NO 释放量随功率密度和照射时间递增（图 2G）。24 h 内，808 nm 激光照射使 UK 释放达 82.7%，无激光时仅 45%（图 2H）。TMB 比色测定显示 MPB-NO-UK@PM 具有 POD 活性且随时间增强（图 2I）。溶氧仪测得 H₂O₂+MPB-NO-UK@PM 体系 O₂ 显著增加，提示 CAT 活性随时间升高（图 2J）。WST-8 结果显示 SOD 活性随 MPB-NO-UK@PM 浓度升高而增强（图 2K）。

图2 MPB-NO-UK@PM的体外特性。（A）MPB、MPB-NO和PBS的温度变化曲线；（B）不同浓度下MPB-NO-UK@PM的温度变化曲线；（C）不同激光功率下的温度升高曲线；（D）不同浓度下MPB-NO-UK@PM的热成像；（E）体外信号-浓度关系的定量分析及不同浓度下MPB-NO-UK@PM的PA图像；（F）在1 W cm−2功率密度下，SNP、MPB和MPB-NO的NO释放曲线；（G）在不同功率密度下MPB-NO-UK@PM的NO释放曲线；（H）激光照射与否下MPB-NO-UK@PM的UK释放；（I）添加TMB底物溶液后的650 nm吸光度；（J）溶解氧仪测得的O2浓度；（K）不同浓度下MPB-NO-UK@PM的SOD活性

（3）剪切力对Piezo1激活的影响

在正常层流剪切力下，Piezo1通道被激活，导致内皮细胞内Ca²⁺增加，进而激活eNOS，促进NO产生（图3A）。顺利获得荧光显微镜观察不同剪切力对HUVECs中Ca²⁺水平的影响，结果表明在15 dyn cm⁻²时荧光信号最强，而在30和45 dyn cm⁻²时内源性Ca²⁺水平显著下降（图3B）。顺利获得流式细胞术进一步验证，剪切力从3增加到15 dyn cm⁻²时内源性Ca²⁺水平上升，但在30和45 dyn cm⁻²时下降（图 3C,D）。免疫荧光实验显示，随着剪切力从3增加到15 dyn cm⁻²，磷酸化eNOS（Ser1177）水平上升，但在更高剪切力下则下降（图 3E,F）。

图3 不同剪切力对Piezo1通道激活和Ca²⁺流入的影响。（A）剪切力、Piezo1通道激活、eNOS激活和NO产生之间的关系示意图；（B）不同剪切力刺激下HUVECs内源性Ca²⁺浓度的Fluo-4 AM荧光显微镜观察；（C）不同剪切力刺激下HUVECs内源性Ca²⁺浓度的流式细胞术分析；（D）流式细胞术荧光强度分析；（E）HUVECs中磷酸化eNOS（Ser1177）水平的共聚焦显微镜图像；（F）对应磷酸化eNOS（Ser1177）水平的平均荧光信号

（4）细胞内摄取和粘附特性、抗血小板聚集能力和H2O2清除能力

巨噬细胞内 MPB-NO-UK@PM 荧光弱（图 4A）。HUVECs 与活化血小板共定位：MPB-NO-UK@PM 信号重叠度高于 Dil-MPB-NO-UK（图 4B）。活化 HUVECs 对 MPB-NO-UK@PM 的摄取量显著高于未活化组（图 4C）。浊度测定：单独 MPB-NO-UK@PM 的聚集率 50.9%，与 PBS 无差异；+NIR 后降至 31.7%（图 4D）。SEM 验证该结果（图 4E）。H₂O₂ 诱导的 HUVECs 内，MPB-NO-UK@PM 显著降低 ROS（图 4F）。H₂O₂ 组凋亡率升高，MPB-NO 和 MPB-NO-UK@PM 均使其回落（图 4G）。

图4  MPB-NO-UK@PM的细胞内摄取、粘附特性、抗血小板聚集能力及H₂O₂清除能力。（A）MPB-NO-UK@PM在RAW 264.7细胞中的吞噬逃逸的共聚焦显微镜图像；（B）MPB-NO-UK@PM靶向活化血小板的共聚焦显微镜图像；（C）MPB-NO-UK@PM靶向活化HUVECs的共聚焦显微镜图像；（D）NIR照射下NO生成的抗血小板聚集效果（n = 3）；（E）血小板聚集程度的透射电子显微镜图像；（F）不同处理后HUVECs中的ROS清除情况；（G）对应的ROS水平的平均荧光信号

（5）体外和体内生物安全性

HUVECs和RAW264.7细胞共培养时，MPB-NO-UK@PM的不同浓度未表现出显著细胞毒性（图5A）。采用活/死细胞双染色法评估光热治疗对HUVECs的损伤，结果显示未出现异常细胞状态（图5B）。与PBS处理的阴性对照相比，稀释的红细胞在与不同浓度的MPB-NO-UK@PM和MPB-NO共孵育后，离心后呈现清澈溶液（图5C,D）。将MPB-NO-UK@PM注入斯普拉格-道利大鼠后，在第1、7和14天进行评估，未观察到血液学参数（图5E）和主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织切片（图5F）显著变化。

图5 体内外生物安全性评估。（A）RAW264.7细胞和HUVECs与MPB-NO-UK@PM共同培养后的相对细胞活力；（B）NIR照射后活/死HUVECs的共聚焦显微镜图像；（C）与不同浓度MPB-NO-UK@PM共同培养后的红细胞图像；（D）与不同浓度MPB-NO-UK@PM和MPB-NO共同培养的血样在540 nm处的吸光度，PBS和超纯水作为阴性和阳性对照；（E）SD大鼠的血常规；（F）SD大鼠主要脏器的H&E染色结果

（6）MPB-NO-UK@PM在血栓中的靶向能力及体内分布

在体外血栓中，MPB-NO-UK@PM的荧光显著高于MPB-NO-UK和对照组DiR，表明其具有更强的血栓靶向性（图6A,B）。体内实验显示，MPB-NO-UK@PM对大鼠颈动脉血栓的靶向能力优于MPB-NO-UK，表现为更强的血栓荧光信号（图6C, D）。纳米复合材料在体内不会长期滞留，能够被有效清除。MPB-NO-UK@PM的血药半衰期（5.886 h）显著长于MPB-NO-UK（3.907 h），表明血小板膜包覆增强了药物的体内循环稳定性（图6E, F）。

图6 MPB-NO-UK@PM在血栓中的靶向能力及体内分布。（A）不同处理后富血小板血栓的荧光图像及强度；（B）富血小板血栓荧光强度的定量分析；（C）不同时间点颈动脉血栓的荧光图像；（D）颈动脉血栓荧光强度的定量分析；（E,F）MPB-NO-UK@PM和MPB-NO-UK的半衰期

（7）MPB-NO-UK@PM在体光热效应及光声成像

纳米复合物光热效应在光热溶栓等应用中重要。大鼠模型评估显示，808 nm 激光照射下，MPB - NO - UK 和 MPB - NO - UK@PM 组血栓区域升温超 PBS 对照组和仅激光组，且 MPB - NO - UK@PM 组更明显（图7A, B）。注射10分钟后，光声成像检测到靶向和非靶向组右颈动脉血栓PA信号，靶向组更强（图 7C）。定量分析显示两组 PA 信号60分钟达峰值、90分钟下降（图 7D）。

图7. MPB-NO-UK@PM在体内的光热效应和光声成像。（A）近红外照射后右颈动脉血栓的热图像。（B）近红外照射后相应的温度变化曲线。（C）不同时间右颈动脉血栓的光声图像。（D）不同时间PA强度的定量分析

（8）体内溶栓治疗

MPB-NO-UK@PM联合NIR治疗组的血栓残留面积最低（25.6 ± 3.7%），显著优于其他所有处理组（图8A, D），体现了协同溶栓作用。该纳米药物还表现出良好的抗氧化和抗炎作用，能有效清除ROS并降低IL-6和TNF-α表达（图8B, E, F, G）。MPB-NO-UK@PM联合NIR照射可显著抑制血栓形成，残留血栓面积仅为14.81 ± 13.7%，优于UK及单独的MPB-NO-UK@PM组（图8H, I），证实了其NIR诱导的NO释放具有显著的抗血栓和预防再聚集作用。

图8.体内溶栓治疗和预防。（A）相应治疗后24 h动脉粥样硬化血栓H&E染色。（B）相应治疗后动脉粥样硬化血栓DHE染色。（C）动脉血栓治疗分组。（D）相应治疗后血栓闭合率定量分析。（E）相应治疗后ROS定量分析。（F）相应处理后颈动脉中IL-6的免疫荧光染色。（G）相应处理后颈动脉中TNF-α的免疫荧光染色。（H）血栓预防实验后颈动脉的H&E染色。（I）血栓预防实验后血栓面积的定量分析